Во время царствования Ивана IV Грозного, (1547—1584) число иностранцев в России еще более возросло, на русскую службу начали приглашать иностранных специалистов различных профессий. Они селились уже не только в Москве, но и в других городах страны, вплоть до Урала. Среди них имелось немало последователей учения Мартина Лютера и Ж.Кальвина, и им было предоставлено право свободного отправления богослужения.
      Многие исследователи отмечают, что протестанты пользовались большим расположением русского царя. Например, русский историк Н.М. Карамзин в своем известном труде «История государства Российского» писал о том, что Иван Грозный «славился благоразумною терпимостью вер», разрешил лютеранам и кальвинистам «собираться для богослужения в домах у пасторов, любил спорить с учеными немцами о Законе и сносил противоречия... никто из них не жаловался на притеснение» .
       Истории протестантизма в России известны иные случаи негативного отношения Ивана Грозного к евангелическим священникам: когда однажды в лютеранский пастор сравнил Лютера с Апостолом Павлом, царь ударил его хлыстом по голове, другого пастора, Фому, единомышленника объявленного еретиком монаха Феодосия Косого, он приказал утопить в Двине.
Один из русских летописцев указывал, что некоторые проповедники прямо склоняли царя к принятию лютеранского «Аугсбургского вероисповедания». Иностранные послы неоднократно сообщали в своих письмах на родину, что Иван IV, возможно, примет евангелическую веру и есть «к тому всякая надежда» .
      Но обращение Ивана Грозного не увенчалось успехом. Во время беседы с евангелическим богословом, в присутствии многочисленной свиты, царь гневно нападал на основные положения лютеранства. Устная полемика переросла в обмен письмами. Грозный написал опровержение Лютеранского богословия, под заглавием «Ответ государев». Называя Лютера человеком свирепым, люто изменившим учение Христа, Грозный достаточно подробно рассмотрел все особенности лютеранского вероучения, употребляя многочисленные цитаты из Писания. Четырнадцатая глава царского сочинения строжайше запрещала Лютеранам распространять свое учение в пределах Московского государства.
     Однако протестантские идеи постепенно распространялись среди населения России.
Уже в конце 1575 г. или в начале 1576 г. пленные иноземцы возвели здесь первую деревянную лютеранскую кирху. Лютеранская церковь появилась в Москве на сто лет раньше, чем католическая.
Уже через четыре года кирху разрушили во время погрома, устроенного в Немецкой слободе по указанию Ивана Грозного. Вот что пишет об этом М.Н. Карамзин: «Иоанн... дозволив лютеранам и кальвинистам иметь в Москве церковь, лет через пять велел сжечь ту и другую» .
После разгрома Немецкой слободы лютеране проводили богослужения в частном деревянном доме, а в 1584 г. была возведена новая кирха, которая просуществовала до начала XVII в. У реформатской общины своя превая церковь появилась в 1629 г в той же части Москвы, где находилась Новая церковь, вторая — в 1660 г. в Архангельске, следующие — в 1689 г. в Вологде и Ярославле.
     Положение протестантов в русском государстве никогда не было устойчивым, оно вызывало противодействие со стороны Русской Православной церкви. В 1632 г. известен случай разрушения протестантской церкви по приказу православного патриарха. В 1643 г, над протестантскими церквами нависла новая угроза.
    2 марта 1643 г. одиннадцать православных священнослужителей во главе с отцом Прокопием и отцом Федосеем из Москвы, в пределах приходов которых проживали иноземцы, подали царю челобитную, в которой просили запретить иностранцам селиться в центральной части города. Причиной такого требования стало то, что немцы «на своих дворах вблизи церквей поставили молитвенные дома», что они «русских людей у себя на дворах держат, и всякое осквернение русским людям от тех немцев бывает», что все это приводит якобы к опустению православных приходов.
Вскоре две лютеранские и одна реформатская кирхи были закрыты. Протестанты пытались сохранить хотя бы самую старую церковь, находившуюся на окраине города, но не помогло даже ходатайство трех придворных докторов, обратившихся к государю с челобитной.
Царский указ предписывал « дома молитвы, которые у немцев поставлены на дворах близ русских церквей, сломать»
Все же, к концу 17 века только в Москве уже проживало около тысячи лютеранских семей .

В 1649 г. Земским Собором был принят важнейший законодательный акт XVII в. Уложение запрещало иностранцам, не принявшим православие, владеть недвижимостью на территории Москвы. Эта же статья предписывала сломать все лютеранские церкви на территории столицы и запрещала строить их рядом с православными церквями. Таким образом, иностранцы были выселены за пределы города, а их церкви снова разрушены. Уложение предусматривало смертную казнь за совращение из православия.
После издания Соборного Уложения и выселения иноземцев за пределы города протестантам необходимо было заново отстроить свои церкви.

Новую страницу в истории протестантизма в России открыл Петр Великий. В годы его царствования (1689— 1725) в России не только значительно выросло число иностранцев, исповедовавших лютеранство и кальвинизм, но и изменился статус Евангелических церквей в обществе. Царь посещал лютеранские богослужения в Немецкой слободе Москвы, где провел много времени в детстве.
В 1695 г. в Немецкой слободе на пожертвования Петра была возведена каменная кирха. Среди ближайших советников Петра были протестанты.